2019年10月1日，5-羟甲（jiǎ）基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究领域取得重要进展。2型（xíng）糖尿病（T2D）的血管并发（fā）症是导（dǎo）致（zhì）2型（xíng）糖尿（niào）病致残致死（sǐ）的（de）重要病（bìng）因（yīn），一直（zhí）缺乏一种（zhǒng）无创（chuàng）便捷的临床途（tú）径实现血管并（bìng）发症的发生发展监（jiān）测，达到（dào）早发现、早（zǎo）干（gàn）预，以（yǐ）提高T2D病（bìng）人（rén）的整体生活质量，减少（shǎo）卫生经（jīng）济（jì）负担（dān）。

该（gāi）研究入组（zǔ）了62例2型糖尿病病人，采用（yòng）5hmC-Seal技（jì）术对血浆cfDNA中表观遗传（chuán）标志物5hmC的分布情况进行（háng）检测，分析（xī）5hmC标志物与2型（xíng）糖（táng）尿病血管并发症发（fā）生发展的（de）相关性。结果表（biǎo）明5hmC标志物的变化与T2D合并大血管/微（wēi）血（xuè）管事件具有（yǒu）相（xiàng）关性，主要涉及一些与血管生物学和糖尿病（包（bāo）括胰岛（dǎo）素（sù）耐（nài）受和炎症（zhèng）反应）相关的基（jī）因和信号通路。该研究建立的16个基因-5hmC标志物组合检测可以准确区分有并发症和无并发症的2型（xíng）糖尿病病人（rén）[实（shí）验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显（xiǎn）优（yōu）于传（chuán）统临（lín）床（chuáng）变量例如白（bái）蛋白尿。除此之外，还（hái）建（jiàn）立了13个基因-5hmC标志物组合（hé）检测，可以进一步区分T2D合（hé）并单一并（bìng）发症和多种（zhǒng）并发（fā）症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其（qí）他传统临床（chuáng）变量（liàng）。该研（yán）究得出结论，5hmC标（biāo）志物反映了T2D病人大（dà）血管/微血管并发症发生（shēng）过程中的表（biǎo）观遗传变化，因而5hmC-Seal检（jiǎn）测（cè）技术在监测糖尿病血管并发（fā）症发生（shēng）和进展方面具有良好的临床应用前景（jǐng）。

本研究共（gòng）纳入62例2型糖尿病病（bìng）人，包括没有血（xuè）管并（bìng）发症（zhèng）的病人（rén）12例，有单一血管并发症的病人（rén）34例（24例发生大（dà）血管事件，10例发生微血管事件），以及有多种血管并发症的病人（rén）16例。试验收集62例病（bìng）人血浆，提取cfDNA，利用（yòng）5hmC-Seal技术捕获外（wài）周血cfDNA中的5hmC序列，进行二代测序（xù），通过生物信息学分析找出并发（fā）症组（zǔ）与无并发症（zhèng）组之间有显著5hmC修饰（shì）差（chà）异的基因，单一并发症组和多（duō）种并发症（zhèng）组之间有显著5hmC修饰差（chà）异的基因（yīn）。随后利用（yòng）回（huí）归模型对（duì）差异基因进一步筛选、优化（huà），弹性网络进一（yī）步（bù）筛选，计算（suàn）加权平均分，最（zuì）后得到一组具有高度灵敏度和（hé）特（tè）异性的5hmC生物标记物，并进一步在实验组中验证，分析其（qí）灵敏度和特异性。并将新建立的5hmC标志物基因组合的检测性能与传（chuán）统临床变（biàn）量进行（háng）对比分析（xī）。最后对（duì）相（xiàng）关（guān）基因（yīn）进行了信号通路分析和（hé）功能探（tàn）究（jiū）。

5hmC修（xiū）饰水平与血管并发（fā）症具有相关性

利（lì）用逻辑回归（guī）模（mó）型对（duì）62例有（yǒu）并发症（zhèng）和无并发症2型（xíng）糖尿病病人的5hmC差（chà）异水平进行分析发现，有并发（fā）症2型（xíng）糖尿病病（bìng）人（rén）的622个差异修饰候（hòu）选基因（yīn）（包括上（shàng）调和下调基因（yīn））的归一（yī）化平均（jun1）数要（yào）明显（xiǎn）高于无并发症的病人（P<0.001），但是单一并（bìng）发（fā）症和多发（fā）并（bìng）发症病人之间没有显著差异（yì）。

之后将有单（dān）一并（bìng）发症或多（duō）种并发症（zhèng）的（de）50例病人用（yòng）逻辑（jí）回归模型进（jìn）行了对比，发现多种并发症的病人的153个差异（yì）修饰候（hòu）选（xuǎn）基（jī）因（包括上（shàng）调和下调基（jī）因）的归（guī）一（yī）化平（píng）均数要低于无并（bìng）发症病（bìng）人（P<0.001）。

5hmC标志物（wù）可（kě）区（qū）分有无并发症患（huàn）者

62例（lì）2型糖尿病病人被随（suí）机（jī）分成训练组（zǔ）（n=31）和测试（shì）组（n=31）。利用弹性网络筛（shāi）选后发（fā）现，16基因-5hmC标志物组（zǔ）合检测可以用（yòng）于区分有并发（fā）症和无并（bìng）发症的2型糖尿病病人。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加（jiā）权平均分（fèn）分（fèn）析，发（fā）现无（wú）并（bìng）发症病人的分（fèn）数在训练集和测试集中都明显低于（yú）有并发症的病人。只考虑加权平均分的（de）话（huà），受试者工作特征曲线（ROC）分析表明将cutoff值（zhí）设（shè）置成0.5时，在测试组（zǔ）中中（zhōng）的（de）灵敏度为60%，特异性为100%。

5hmC标志（zhì）物可区分病人是单一并（bìng）发症还是多种并发症

50例有并（bìng）发症的（de）2型糖尿（niào）病（bìng）病人被随机分（fèn）成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性网络（luò）筛选后发现，13基因-5hmC标志物组合可（kě）以区分2型（xíng）糖尿病病人是否发生单一并发（fā）症或多种（zhǒng）并发症。

基于13基因组合（hé）模型 (Detection Model 2)， 我们计算（suàn）了单一并发症和多（duō）种并发症的加权平均分，发（fā）现在训练集和测试集中单（dān）一并发（fā）症和多（duō）种并发症病人的分数都有（yǒu）明（míng）显差异。值（zhí）得一（yī）提的（de）是，有（yǒu）肾病并发症和无肾病并（bìng）发症（zhèng）病人的分数也有（yǒu）明（míng）显差异。利用加权平（píng）均（jun1）分作为判断标准（zhǔn）的受试者（zhě）工作特（tè）征曲线（ROC）表（biǎo）明，在（zài）测试（shì）组（zǔ）中当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为（wéi）68.8%。

5hmC标志物与（yǔ）传统临床变量/危险因子的对比

我们（men）评估（gū）了不同临床变量/危（wēi）险因子用（yòng）于监测（cè）血管（guǎn）并发症的灵敏（mǐn）度和（hé）特异性（见表1）。

信号通路（lù）分（fèn）析和功能探究

有（yǒu）并发症和无并发症病（bìng）人的135个差异（yì）候选（xuǎn）基因（yīn）的功能注释分析表明，这些基因主要富（fù）集在一（yī）些经典（diǎn）的信号通路。错（cuò）误发现率相关P值位于前10%和基因（yīn）数目≥3的信号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导（dǎo）的信号通路。由IGF1R和IL-10介导的信号通路与胰岛素（sù）抵抗及炎（yán）症反应相（xiàng）关，在血管生物学和糖尿（niào）病（bìng）发生发展过程（chéng）中（zhōng）发挥重要作用。

Reactome相互作用（yòng）网络的中心表明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基核糖体蛋白融（róng）合产物1(UBA52)]是候选基因（如（rú）SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重（chóng）要连接者。在这135个差（chà）异候选基因中, 一些（xiē）基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病（bìng）病程相关的倾向（xiàng），表明5hmC和糖尿病血管并发（fā）症之（zhī）间可能存（cún）在（zài）时间依赖性的（de）相互作用。基于纵向时（shí）间队列（liè）的大样本研究，将可进一步明确5hmC变化和糖尿病（bìng）持续（xù）时间之（zhī）间（jiān）的动态关联。关于（yú）单一（yī）并（bìng）发症（zhèng）和多种（zhǒng）并发症（zhèng）病人的159个候选标志基因的功（gōng）能注释（shì）研究发现，存在细胞-细胞连接、胶原蛋（dàn）白形成、新陈代谢、细（xì）胞应（yīng）激应答信号通（tōng）路的富集，这些信号（hào）通路均（jun1）与细胞基本功能（néng）密切（qiē）相关。

血（xuè）管并（bìng）发（fā）症（zhèng）是三分（fèn）之二（èr）糖尿病病人的死亡（wáng）原因，若能（néng）及早（zǎo）有效控制血管（guǎn）并发症的发生，将（jiāng）极大地改善糖尿（niào）病（bìng）病（bìng）人的（de）生存质（zhì）量。该（gāi）研究建立了一种利用cfDNA进（jìn）行2型糖（táng）尿病（bìng）血管并发症（zhèng）监测的无创（chuàng）便捷（jié）方法，较目前临床标志物能（néng）更准确（què）地监控血（xuè）管并发症的发（fā）生，从而提示临床及（jí）早采取应（yīng）对措施，有效（xiào）控制病（bìng）情进展。